实验室100g玉米湿磨程序

  • 作者: 刘小兵 译自《谷物化学》1996年第1期,总第73卷
  • 时间: 2019-08-28 14:16:33
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摘要  实验室100g玉米湿磨程序是在检测玉米样品研磨特性时为减少所需的样品规模和劳动时间而研发的。该程序的淀粉收率在统计学上类似于实验室1kg程序的结果,如果在同一周内进行重复实验,重复标准差为0.36%,如果一年时间内每周都进行重复实验,重复标准差0.60%。在适当配备实验设施的实验室中,三名受过培训的实验员可以每周40个样品的速率操作此程序。

ABSTRACT  A 100-g laboratory corn wet-milling procedure was developed in order to reduce sample size and labor time requirements for determining the milling characteristics of corn samples.  The procedure gives starch yields statistically similar to those of a 1-kg laboratory procedure with a standard deviation in replicates of 0.36% when the replicates were performed during the same week, and 0.60% when replicates were performed weekly during the course of a year.  In a properly equipped laboratory, the procedure can be performed at the rate of 40 samples per week using three trained personnel.

 

        生物技术和基因工程在开发玉米杂交品种上的应用提高了玉米湿磨装置加工黄马齿杂交玉米而非杂交商品玉米的可行性。目前广泛使用的速度较慢的分析性研磨方法部分地限制了更适合于湿磨的杂交品种的鉴别。

        300~1,500g样品并投入相应人力与时间的实验室规模的研磨程序可以评估玉米的研磨质量(可研磨性)(Dimler等人 1944Watson等人 1951Watson等人 1955Zipf等人 1959Anderson 1963White等人 1990SteinkeJohnson 1991Eckhoff等人 1993Wehling等人 1993)。因为进行物料平衡时的步骤,所需的人力与时间常常把每位实验员的试验个数限制在每周四到六个样品。为充分利用新的杂交品种开发技术,种子公司和湿磨企业需要在短时间内对大量样品进行评估,满足当前生产程序的决策需要。这就产生了对实验室规模研磨程序的需求,要求它比现有的实验室程序更加快捷,同时,样品规模更小(100g或以下)

        PelshenkeLindemann(1954)100~200g的玉米研磨方法比传统的300g1kg样品规模方法要复杂得多。玉米浸泡后,手工解剖分离出胚芽,这增加了样品处理所需的时间,而且,人们仍无法获悉机械分离胚芽容易与否或胚芽耐受机械力方面的信息。这种方法还需要两次离心分离和洗涤,然后,才能进行淀粉流槽分离,以及两次纤维洗涤步骤。该方法还缺乏一些重要的详细使用信息,如流槽斜率、每一步水的用量、最后洗涤时淀粉流槽上加水的流速以及上流槽前淀粉-蛋白质浆料的比重。虽然PelshenkeLindemann程序的样品规模为100g,但它和其它实验室方法一样耗时。该方法准确度较高,淀粉收率约为69%时,淀粉收率标准差为0.2%

本次研究的目的是开发实验室100g样品规模湿磨程序,该程序融入了PelshenkeLindemann(1954)法的内容,但可以以更快的速度和相似的精度常规地操作,并对这个程序进行了评估。

方法与材料

1.1 100g湿磨程序的描述

        浸泡。将玉米(100g)样品(湿重)置于500ml锥形平底烧瓶中,加入180ml浸泡液,浸入52水浴器中,无搅拌或浸泡液循环。用10372hr强制空气烘箱法(AACC 1983)一式三份准确测量样品初始水分含量,这对(样品)初始干重的估算至关重要。浸泡时间可以视24hr浸泡的情况而改变,这是维持日常研磨体制的实用方法。浸泡液含2,000ppm的二氧化硫和0.5%(w/w)的乳酸,当然,二氧化硫和乳酸的量是可以调整的。

        浸泡结束后,将浸泡水倒入一个250ml的量筒,测量剩余的浸泡水体积。用两步干燥法(AACC 1983)干燥浸泡水,检测固形物含量。由于要蒸发的水很多,所以,两步法优于一步干燥法。

        粗磨。用配有1L玻璃容器()和半径缘不锈钢刀片的Waring型搅拌器(美国康涅狄格州Dynamic Corp. of America出品)加入等量的水研磨浸泡好的玉米。刀片长6.3cm、厚0.3cm、宽1.0cm,仰角40°。搅拌器配有监测刀片转速的转速计,一个可变变压器将刀片转速保持在7,500~7,600rpm。转速控制很重要,因为在相同负载下,搅拌器的工作转速会不同。转速的控制也弥补了搅拌器自然老化引起的功率损失。

        胚芽与粗纤维洗涤。500ml水将粗磨得到的浆料移入一10L桶底部的、量过皮重的标准测试筛(美国7号,2.80mm)。桶底和筛应该紧密无缝地结合就位。桶筛一体可摇动(Ro-tap测试筛振动器,美国俄亥俄州W. S. Tyler Co.,出品),轻叩筛分持续5min。振动期间,用一把小刮刀定期地将浆料分散在筛表面。筛上滞留物为完整和不完整的胚芽及大块的玉米果皮(粗纤维)。筛子的振动是为了磨掉胚芽的胚乳和粗纤维,同时,也是清洗胚芽和纤维。胚芽的细小碎片通过筛子后,和细纤维一起回收。用两步干燥法(AACC 1983)对带有回收胚芽和粗纤维的、量过皮重的筛子进行干燥,通过称重筛子、减去筛子的初始空重得到胚芽和粗纤维的总重。量过皮重的筛子的使用避免了因处理材料造成的损失。

        精磨。在一个平板磨(4-EQuaker City,美国宾州The Straub Co.出品)上细磨脱胚浆料(通过7号筛的浆料)。必要的研磨细度是增加磨的平板压力来实现的,直到电机开始显著加载。边搅拌边使浆料通过磨机。待脱胚浆料通过磨机后,用250ml水冲洗磨机、料桶等其它设备;该清洗水和样品保存在一起。

        磨盘的准备对于保持磨机的精度非常重要。新磨盘需要研磨一下,使得盘面之间有足够的接触面积,这样才能适当地研磨样品。如果新磨盘没有事先准备好,淀粉收率就会低。经验表明,磨机需运行冷却水研磨磨盘105hr,才能达到所需的接触面积。在磨盘上保持足够的压力才能获得所需的接触面积,而且,应在与研磨玉米时通常使用的相同程度的电机负载下操作。为确保磨盘磨损充分,用旧磨盘估计收率数据的玉米样品应用新磨盘进行研磨。应使用新、旧磨盘进行充分重复,确保结果具有可比性。还有一点也应注意到,不同的Quaker City磨,磨盘会因轴位的微小变化而稍有不同。建议磨机在磨盘的使用寿命期间内持续使用一组磨盘。

        磨盘的使用寿命约为1,000个样品。样品在1,000左右时,磨盘已经形成了足够的接触面积,若继续使用,淀粉收率略有增加(1~2%)。使用磨合充分的磨盘的主要问题是样品通过磨机所需的时间显著增加,淀粉-蛋白质组分中含有过多的细纤维,会对淀粉的回收产生负面影响(EckhoffTso 1990)

        细纤维分离。精磨后,浆料静置30~45min,之后,倒出约750ml水。将倒出的浆料移入一安装在7.5L水桶(美国明尼苏达州ACE Industries Inc.出品)上的标准试验筛(美国200号,75μm)内。将安装了筛子的水桶放置在Ro-Tap试验筛振动器或类似的设备上,可轻叩筛分,边振动,边用水冲洗浆料,时间持续5min

        洗涤时,边在浆料上倒水边用一把小刮铲连续地分散浆料。用水清洗后,筛上物用500ml瓶水进行喷射洗涤。

 用小扁铲按压洗涤后的筛上物脱水,移入两个称过皮重的杯子中,用两段空气烘箱法(AACC 1983)进行干燥。也可以事先对该筛子称重,排除这种固体的转移,但细纤维在200目的筛上有干燥和堵住筛网的趋势。虽然建议定期使用超声清洁器(USC 200-90,德国Haver & Boecker出品)清洁所有筛网,但在200目筛上干燥细纤维仍需要每天进行超声清洁。

        淀粉-蛋白质分离。用称过皮重的5.08cm×2.44m铝制通道作为淀粉流槽来实现淀粉-蛋白质的分离,根据以前的研究(Singh 1995),流槽的斜率确定为0.0104(cm/cm)。使用前的干燥淀粉流槽横跨在两个天平——两个天平分别置于流槽的两端——上称重。两个天平重量之和为流槽初始重量。流槽长度根据其在实验室内移动进行称重和环境干燥的需要来确定。

        将去除细纤维后剩下的淀粉-蛋白质混合物中的液体持续1hr缓缓倒出,将其比重调整至1.04~1.045。如果倾析后,比重仍很高,可加入适量的倾析水,获得理想的比重值。倾析液可用于后面的回收淀粉的洗涤。将倾析后的浆料以50~52ml/min的速度泵上淀粉流槽,收集溢流(主要为小而轻的颗粒状淀粉和蛋白质)

        将淀粉-蛋白质混合物泵完后,立即以相同的泵速将倾析水(比重1.002)泵上流槽。用倾析水冲洗完成时,再用125ml水冲洗桶壁,然后,再将其泵上流槽。

        流槽分离完成后,让淀粉置留在流槽上过夜(至少6hr),对分离出的淀粉进行环境空气干燥。然后,在天平上对风干淀粉进行重新称重,得到湿淀粉重量。将淀粉从流槽上刮下,放入两个称过皮重的、250ml铝杯中,用1352hr强制空气烘箱水分测量法(AACC 1983)检测水分含量。通过流槽淀粉的水分和淀粉的总湿重,可以计算出淀粉的总干重。为确保准确估计水分含量,从流槽上刮下尽可能多的淀粉是很重要的,但不必回收所有的淀粉。

        因两段干燥法能有损于淀粉的流变特性,所以,只能取一部分流槽分离的淀粉来检测水分含量(一式三份,每份5g)。这就能有40~50g淀粉用于其它的检测。然而,必须注意的是这15g用于水分检测的淀粉应能代表整个淀粉样品。

        蛋白质过滤。淀粉流槽的溢流在550~650mm.Hg下,用直径为25.3cmBuchner漏斗和直径为24cm的称过皮重的定性滤纸进行真空过滤(英国Whatman International Ltd.出品)。测量通过真空过滤机的液体(蛋白质滤液)体积,取有代表性的样品进行固形物分析。用两段空气烘箱法(AACC 1983)对滤纸上的固形物进行干燥,检测总蛋白质分量干重。

        蛋白质组分的过滤即繁琐又费力。对于主要目的是定量评估淀粉收率的实验来说,可以测量淀粉流槽溢流的体积,像测量浸泡水固形物那样,测量浆料的固形物含量。浆料应该充分搅拌,以确保有代表性的取样,用两段空气烘箱法(AACC 1983)对三份75ml的样品进行固形物分析。

        胚芽回收。如前所述,从烘箱中取出干燥的胚芽和粗纤维,与筛子一起称重。减去筛重,得到胚芽和粗纤维总干重。然后,用手轻轻揉搓筛上干物质,破坏胚芽和纤维的连接,将它们彻底分开,用压力为2,0002,500mm.Hg的吸气嘴吸取粗纤维。吸气嘴到筛底的距离应保持在20~30cm之间。在吸取粗纤维的同时,应保持筛子不停地左右摇晃。这种方法可为吸取纤维,而非胚芽,提供足够的气流。再次对筛上剩下的胚芽进行称重,以估计回收胚芽的总干重。两次称重的差值为粗纤维的量。

1.2 样品准备

        在一个筛眼为4.76mm(12/64英寸)的圆孔振动筛(美国明尼苏达州Dean Gamet Mfg. Co.出品)上将黄马齿玉米过筛,以去除外来物质和破碎玉米。取150g玉米用来检测水分含量(AACC 1983),将剩余玉米置于4贮藏,直至开始湿磨。

1.3 100g湿磨法和1kg湿磨法之比较

        从当地获得代表商业玉米杂交混合品种的样品,并对其进行细分,等待研磨。将样品分成若干等份,五份用Eckhoff等人(1993)1kg法研磨,另外五份用100g法研磨。

        用一台未配对、参数化双尾t检测仪(SigmaStat统计分析系统,1.00版,Jandel Corp.出品)比较两组受检样品的检测平均值。

1.4 方法的准确性

        为了评估检测的标准偏差,取1993年农业生产种植季里机械收获的FR618×FR600玉米杂交品种并在室温下将水分22%(wb)风干到14%(wb)。三十份,每份100g的重复样品在一周内湿磨。

        为评估该方法在时间上的稳定性,取机械收割19931994农作物生产年种植的单一玉米杂交品种(FR1064×LH59),将水分含量22%风干至14%。将玉米分成若干小份,每份100g,封入塑料袋中,冰箱冷藏,直至使用。在实验进行的几个星期里,每周都要用一份杂交玉米样品进行湿磨,并将淀粉收率作为检验该方法在一定时间内稳定与否的指标。

结果与讨论

2.1 100g1kg方法的收率比较

 对于所有回收分量来说,100g1kg方法的各分量平均收率(1)均无明显差异(α=0.05)。两种方法的总收率都在98%以上。在100g方法中,98%的总收率由于格外的小心,减少了回收产品在容器之间的转移。在1kg方法中,称过皮重的淀粉流槽的使用最为关键,因为从流槽上回收干淀粉是一项繁琐且耗时的工作,一定的淀粉损失在所难免。定量回收流槽表面的淀粉是不容易的。1kg方法中,98%的回收率意味着20g淀粉不能计算在内。而100g方法,98%的回收率意味着损失2g淀粉。

    浸泡水固形物的含量也有相似的情况。有人担心100g方法所使用的静态浸泡(浸泡水不会通过玉米强制循环)可能会造成浸泡不够充分。1kg方法中,浸泡水的循环主要是有助于保持玉米浸泡的温度均匀一致。因为100g方法所用的样本量小,浸泡时可与浸泡水密切、充分接触,温度分布比大样本量时要更均匀。基于本文提供的数据和我们实验室另一些未公布的数据,似乎不需要在100g浸泡方法中实施浸泡的循环。

        至于回收的纤维量,这两种方法之间没有统计学上的差异。这很令人惊奇,因为在100g方法中,使用的是200(75μm)筛网来回收细纤维分量,而在1kg方法中,用的是325(50μm)筛,在100g方法中,粗纤维是从细纤维中分离出来并加以回收的。两种方法均采用往复筛来加工纤维,但筛子振动器的作用不同。纤维加工对于回收淀粉非常重要,因为总有淀粉附着在纤维上,需要用机械剪切的方式来回收。

        尽管在5%的水平上没有统计学上的差异,但胚芽平均收率差异为0.68%。目检对比发现,100g方法回收的胚芽要更纯净一些,原因可能是100g方法使用筛选而非悬浮、撇取的方式回收胚芽。在粗磨得到的胚芽样品中,胚芽很脆弱,易于破碎,1kg方法可以回收这些破碎的胚芽,但100g方法却不能。在随后的样品中可以观察到这个问题。然而,在检测基因差异上,100g方法在描述胚芽回收特性上更为敏感。

        两种方法在回收淀粉收率无显著差异。100g方法的标准差小于1kg方法的标准差(0.400.89%)Eckhoff等人(1993)以前使用1kg方法淀粉收率的标准差为0.31%SinghEckhoff (1995)0.14%,这组数据比更早用1kg方法观测到的数据更具可变性。另一些方法在检测淀粉收率方面报告了类似和较高的标准差:0.5%(Anderson 1963)0.7%(SteinkeJohnson 1991)0.4%(Steinke等人 1991)2.24%(Wehling等人 1993)2.90%(Fox等人 1992)0.96%(Shandera等人 1995)。标准差0.5%可以用来描述具有商业意义的杂交品种之间的遗传差异。商业杂交品种的淀粉收率将在10~18%之间变化。Eckhoff(1995)100g方法检测了131个商业杂交样品,发现淀粉收率在54~72%不等,而Fox等人(1992)27个商业杂交品种发现了50.9~60.0%的淀粉收率。0.5%的标准差意味着淀粉收率差异为1.0%的样品可以被视为具有95%置信度的差异。淀粉收率增加1.0%,基于淀粉和麸质饲料价值的差值,淀粉生产企业每蒲式耳玉米的价值大约增加{value}.03

        两种方法在蛋白质收率上无显著差异。100g方法还是有较低的标准差(0.280.43%)。用1kg方法,Eckhoff等人(1993)报告了蛋白质收率0.31%的标准差,而SinghEckhoff(1995)则报告了0.22%的标准差。Anderson(1963)报告了0.8%的标准差,而SteinkeJohnson(1991)Fox等人(1992)则分别报告了0.30.61%的标准差。

2.2  方法的准确性

        三十份玉米杂交品种FR618×FR600,平均淀粉收率67.5%,标准差0.36%。用100g方法与我们实验室另一些较小规模的研究进行比较来评估该方法的准确性,其中标准差从0.250.60%不等。Singh(1995)1kg方法湿磨了商品玉米(混合杂交品种)样品,五份样品的平均淀粉收率为67.3%,标准差为0.40%

    图1显示,在收集数据的两年中,100g方法的标准差都保持在0.60%或更低。这两年的平均淀粉收率有差异:1993年,淀粉平均收率为69.5%,标准差为0.55%1994年淀粉平均收率66.9%,标准差0.60%。如本次研究所观察到的,随着时间的推移,方法的精度通常低于短时间内复制实验的精度(0.360.60%)。结果表明,随着时间的推移,这种方法的漂移很小。最重要的是,结果表明,用冷藏的标准玉米可以为100g方法提供必要的质量控制。

2.3  方法执行的速率

        经验表明,一个设备齐全的实验室和三位受到适当训练的实验人员每天可处理八批次样品,每周五天。对研磨操作人员的必要培训比1kg方法所需要的更为广泛(Singh 1995)。因为研磨过程中应该防止固形物的流失,所以,一些额外的培训是需要。实验人员需要有较高的实验技能,才能执行有足够重复性的实验方法。

        虽然用该方法只需两名实验人员每天可研磨10~12批次样品,但每批次各种空的、满的秤盘和筛子的称重仍是提高该方法执行速率的主要限制瓶颈。每天研磨八批次样品需要2人;第3个人的工作是样品称重、给计算机输入实验数据、各种一次性物品的采购以及各种协调沟通。在刚刚过去的两年里,我们的实验室用这种方法每年执行了约1,500批次的研磨样品。

结论

 本方法给出了总固形物回收及收率在统计学上与Eckhoff等人(1993)1kg方法相当的产品收率的可重复结果。在一周内反复进行一个杂交品种的实验时,该方法的准确度为0.36%,当每周进行重复实验时,准确度0.60%